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Wissenschaftliche Abschlussarbeit - Detailansicht

Bereich Mathematik und Naturwissenschaften - Fakultät Chemie und Lebensmittelchemie - Professur für Bioanalytische Chemie

Analytische Charakterisierung des Biosilikats von Synura sp.
Art der Abschlussarbeit
Master
Autoren
  • Butscher, Daniel
Betreuer
  • Prof. Dr. Eike Brunner
  • Dr. Susanne Machill
Abstract
Bei der Gattung Synura handelt es sich um einzellige eukaryotische Süßwasseralgen, welche in kugelförmigen Kolonien zusammengeschlossen vorkommen. Sie sind wie die Diatomeen ebenfalls in der Lage, eine silifizierte amorphe Zellwand zu bilden. Die Synura besitzen keine geschlossene Zellwand, wie es bei den Kieselalgen der Fall ist, sondern sich überlagernde spezies-spezifische Silikatschuppen. Bei dieser sind die an der Biomineralisation beteiligten und dirigierenden Biomoleküle nahezu unerforscht, es wird jedoch eine starke Analogie zu den Diatomeen vermutet.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Untersuchung der biosilikat-assoziierten organischen Biomoleküle der Synura petersenii (S. petersenii). Zuerst erfolgte die Optimierung der Zuchtbedingungen, insbesondere des Zuchtmediums. Aufgrund der nicht erfolgreichen Antibiotikabehandlung wurde eine axenische Kultur von S. petersenii bestellt und für die weiteren Versuche verwendet. Sowohl von der nicht axenischen Kultur sowie von der axenischen Kultur wurden mehrere 20 L-Ansätze gezüchtet. Des Weiteren erfolgte die Zucht eines mit 13C, 15N und 29Si dreifachmarkierten 20 L-Ansatzes der axenischen Kultur. Mit dem im Arbeitskreis etablierten Verfahren zur Entfernung der rein physikalisch an das Biosilikat gebundenen Organik mittels Lysepuffer konnte lediglich beim Ansatz B ein weißliches Biosilikat erhalten werden. Bei den restlichen Ansätzen führte diese Behandlung zu einem schleimartigen Rückstand. Daher wurden verschiedene Extraktionsmethoden im kleinen Maßstab getestet und IR-spektroskopisch auf die Effektivität zur Entfernung der Organik untersucht. Die Behandlungen mit NaOCl (0,5 %, 30 min, RT) und HCl (20 %, 30 min, RT) lieferten die besten Ergebnisse, weswegen diese bei den Ansätzen I (NaOCl) bzw. J (HCl) durchgeführt wurden.
In Raman-Messungen der nativen S. petersenii-Zellen konnten die vorhandenen Banden den Pigmenten zugeordnet werden. Welche Pigmente vorhanden sind, konnte mit dieser Methode jedoch nicht geklärt werden. Nach dem Ausbleichen der nativen Zellen wurden mittels Raman-Imaging weitere Zellkomponenten untersucht. Dabei wurden Proteine über die gesamten Zellen sowie neutrale Lipide, welche nur lokal vorlagen, detektiert. Weitere Informationen könnten mithilfe der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (surface enhanced raman spectroscopy, SERS) erhalten werden. Dazu könnten die Zellen mit Nanopartikeln inkubiert werden. Bei Diatomeen ist allerdings bekannt, dass diese in der Lage sind in-vivo Gold-Nanopartikel zu erzeugen, welche für SERS-Messungen verwendet werden können. Bis dato ist bei Synura unbekannt, ob diese ebenfalls dazu fähig sind, entsprechende Nanopartikel in-vivo zu bilden.
Beruhend auf den Vorarbeiten von Stepan Geri und Lukas Reiß wurden die Ergebnisse der Saccharid- und Aminosäureanalytik am Biosilikat einer axenischen sowie einer nicht axenischen Kultur wiederholt und validiert. Die mittels GC-MS bestimmten Hauptbestandteile der biosilikat-assoziierten Polysaccharide waren in allen Ansätzen Mannose, Galactose und Glucose. Des Weiteren konnten die Monosaccharide Rhamnose, Ribose, Fucose, Xylose und Glucosamin vorgefunden werden. Das im Biosilikat gefundene Glucosamin könnte einen Hinweis auf das Vorhandensein von Chitin geben. Daher wurden die Biosilikate mit Chitinase behandelt und anschließend gaschromatographisch auf N-Acetylglucosamin untersucht, wobei dieses in keiner Probe detektiert werden konnte. Im NH4F/HFunlöslichen Rückstand konnten in allen Proben intensitätsschwache Peaks von N-Acetylglucosamin und somit Spuren von Chitin im Biosilikat nachgewiesen werden. Dadurch konnte jedoch nicht die signifikante Menge an Glucosamin in den Chromatogrammen nach saurer Hydrolyse erklärt werden. Die Aminosäurenzusammensetzung der biosilikat-assoziierten Proteine von S. petersenii wurde mit einer LC-MS-Methode nach vorhergehender Hydrolyse untersucht. Im Ansatz J (HCl) machen die Aminosäuren einen Massenanteil am Biosilikat von 56,8 %, beim Ansatz B (Lyse) 24,4 % und beim Ansatz I (NaOCl) 14,3 % aus, was gut mit den Ergebnissen der IR-Spektroskopie übereinstimmt. In allen Ansätzen konnten Asparagin(säure), Glutamin(säure) und Alanin sowie zusätzlich im Ansatz I Leucin und im Ansatz B Glycin als Hauptaminosäuren bestimmt werden.
Am dreifachmarkierten Biosilikat wurden 13C{1H}- und 15N{1H}-CP-MAS-NMR-Spektren sowie ein HPDEC-29Si-NMR-Spektrum aufgenommen. Zudem wurde zum ersten Mal am Biosilikat von S. petersenii ein 13C{29Si} REDOR-Experiment durchgeführt. Dabei konnte beim Signal bei 54,5 ppm eine starke Dephasierung ausgemacht werden. Durch Bestimmung der REDOR-Fraktion und Auswertung der erhaltenen Kurve mit der Näherung erster Ordnung ergab sich ein zweites Moment M2 = 2,58 · 104 Hz2. Dieser hohe Wert für M2 liegt in einem Bereich, der auf einen engen Kontakt zwischen den 13C- und 29Si-Spins hindeutet. Der Ursprung dieses Signals liegt, aufgrund des sehr scharfen Signals der LCPAs (long-chain polyamines) im 15N-Spektrum, sehr wahrscheinlich bei den LCPAs. Dies könnte über ein 15N{29Si} REDOR-Experiment weiter untersucht werden. Zudem wäre die Untersuchung der silikat-assoziierten LCPAs von großer Bedeutung.
Zugeordnete Forschungsschwerpunkte
  • Bioanalytische Methoden
Schlagwörter
Analytische Charakterisierung des Biosilikats von Synura sp.
Berichtsjahr
2020
Stand: 29.06.2020